常见转染问题解答

下是在使用我们的转染试剂过程中,经常遇到的技术问题。我们针对这些问题分析了可能的原因,以及列出了故障如何排除等如果你碰到的问题无法下表中找出,请将您在转染操作中遇到的问题电邮至 info@signagen-china.com我们的技术支持将竭尽所能为您找到一个解决方案。

转染问题

可能的原因

建议解决方法

转染效率低

没有选择最合适的转染试剂

针对待转染细胞选择最适的转染试剂是 获得高转染效率的关键。如果您对选择我们哪一种转染试剂没有把握,请致电至 info@signagen-china.com寻求技术支持。

没有生成高效率的DNA-转染试剂复合物

制备生成DNA-转染试剂复合物时,请不要使用任何含有血清的产品。在大多数情况下,使用不含血清的DMEM培养液能获得高效率的DNA-转染试剂复合物。
注意:请避免使用Opti-MEM培养液,即使其血清含量较低。

在生成DNA-转染试剂的过程中存在抑制复合物形成的抑制剂。

不含血清的培养液是高效DNA-转染试剂复合物形成的关键。在生成复合物过程中,避免使用以下化学物质:高浓度的磷酸盐;硫酸软骨素透明质酸硫酸葡聚糖或其它硫酸化的蛋白聚糖

阳离子型脂质体被意外冷冻保存。

务必将以下阳离子型脂质体保存于+4度环境,-20或者-80度冷藏将显著降低其转染效率:LipoD293™, LipoJet™PowerFect™等。

细胞密度未优化。

DNA转染和DNA-siRNA共转染过程中,控制细胞密度在60~70%之间;siRNA转染过程中,控制细胞密度在50%左右。

使用了次优化的反应条件,如转染试剂的用量,DNA用量和DNA-转染试剂复合物的形成时间等参数没有优化。

如果您不清楚最优化的反应条件或者不知道如何针对待转染细胞进行条件优化,请致电至 info@signagen-china.com寻求技术支持。

确定转染效率的方法学问题。

建议每次转染时,设定一个阳性对照,如绿色荧光蛋白(GFP)

所使用DNA的启动子不能被待转染细胞所识别。

在转染实验前,请确认所转染DNA确实能在待转染细胞内表达。

在使用GenMute™GenJet™, PowerFect™PepMute™ siRNA转染试剂和LipoJet™ DNA转染试剂时,没有使用与之匹配的转染缓冲液。

GenMute™GenJet™, PowerFect™PepMute™ siRNA转染试剂和LipoJet™ DNA转染试剂均配有特制的转染缓冲液。为了获得高效率转染,请务必严格按照转试剂的操作步骤进行,在形成DNA-转染试剂或者siRNA-转染试剂复合物时,请务必使用与之匹配的缓冲液。

将转染复合物长时间放置于室温。

转染复合物的最佳放置时间和温度是室温条件下10~20分钟,长时间放置会显著地降低转染效率,请务必控制放置时间在20 分钟之内。.

使用LipoD293™和 PolyJet转染试剂时,细胞的密度太低。

使用LipoD293™和 PolyJet转染试剂时,细胞的密度控制在~70%为宜。

极高转速离心转染复合物。

在形成转染复合物时,标准操作步骤推荐数秒内涡旋混合转染试剂和DNAsiRNA以生成高效转染复合物。如果想将粘附于管壁的复合物离心到管底,请务必使用极低转速离心,如80g离心5秒钟足够,离心转速太高将显著降低转染复合物的转染效率。

对于难转细胞如MDCK, MB2231C2C12SaoS-2等转染效率很低。

使用了错误的转染操作步骤。

在使用GenJet™LipoD293™PolyJet™转染试剂对MDCK, MB2231C2C12SaoS-2等难转细胞进行转染操作时,建议使用Advanced Protocol

细胞毒性大

DNA用量太大。

建议绘制量效关系曲线来确定最佳的DNA用量。

转染试剂用量太大。

建议绘制量效关系曲线来确定最佳的转染试剂用量。

细胞密度太低。

转染DNA时,建议细胞密度控制在~70%左右;转染siRNADNA/siRNA共转染时,建议细胞密度控制在50~70%为宜,细胞密度太低可导致转染过程 细胞毒性增加。

转染时细胞状态已经较差。

我们所生产的所有转染试剂其转染效率均不受培养液中的血清影响,因此建议转染过程中细胞的培养液使用含有10%胎牛血清和抗生素的完全培养液以改善细胞的状态。

稳定转染时抗生素加入时机太早。

在转染48小时后加入选择用抗生素。

使用PepMute™GenMute™或者PepMute™ Plus siRNA 转染试剂时毒性太大。

错误地使用了含有血清和抗生素的DMEM培养液来稀释转染试剂和siRNA

使用PepMute™, GenMute™, GenJet™PowerFect™ siRNA转染试剂时,我们推荐务必使用特制的转染缓冲液来稀释转染试剂和siRNA以形成高效的转染复合物并降低细胞毒性。

转染效果不稳定,不能重现。

转染时细胞密度没有控制的较为均一,差异太大。

严格控制细胞生成条件,务必使每一次转染时细胞的密度较为均一。如果细胞传代太多,建议重新复苏一批新鲜细胞进行培养。

转染试剂有时呈云雾状浑浊。

转染试剂储存问题太低。

请务必不要低温保存转染试剂,+4度环境即可;如果将转染试剂误放在-20以下环境,建议将冰冻的转染试剂(LipoD293™LipoJet™转染试剂除外)温浴10分钟后,待完全融化后,再进行转染操作。一般情况下不会导致转染效率降低。

转染复合物出现沉淀。

有过量的EDTA存在。

DNA溶于纯水而不是TE缓冲液.

在形成转染复合物时,有过量的转染试剂或DNA/siRNA存在。

确保在转染复合物形成过程中,转染试剂和DNA或者siRNA的用量最好不要超过标准错作步骤推荐的剂量。

siRNA转染时,基因沉默效率不够高。 没有使用特制的转染缓冲液来稀释转染试剂和DNA/siRNA 使用PepMute™, GenMute™, GenJet™PowerFect™ siRNA转染试剂时,我们推荐务必使用特制的转染缓冲液来稀释转染试剂和siRNA以形成高效的转染复合物。
所使用的siRNA浓度此优化。 使用PepMute™, GenMute™, GenJet™PowerFect™ siRNA转染试剂时,我们推荐的siRNA终浓度为1.0~50 nM,对较易转的细胞,siRNA终浓度以5 nM为宜,对难转细胞可以考虑提高到50 nM
DNA-siRNA转染时,基因沉默效率不够高。 没有使用特制的转染缓冲液来稀释转染试剂和DNA/siRNA 使用PepMute™, GenMute™, GenJet™PowerFect™ siRNA转染试剂时,我们推荐务必使用特制的转染缓冲液来稀释转染试剂和DNA/siRNA
所使用的siRNA浓度太高或者太低。 使用PepMute™, GenMute™, GenJet™PowerFect™ siRNA转染试剂时,我们推荐的siRNA终浓度为1.0~50 nM,对较易转的细胞,siRNA终浓度以5 nM为宜,对难转细胞可以考虑提高到50 nM

 


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